Ecological characterisation and infection of Anophelines (Diptera: Culicidae) of the Atlantic Forest in the southeast of Brazil over a 10 year period: has the behaviour of the autochthonous malaria vector changed?

BACKGROUND In southeastern Brazil, autochthonous cases of malaria can be found near Atlantic Forest fragments. Because the transmission cycle has not been completely clarified, the behaviour of the possible vectors in those regions must be observed. A study concerning the entomological aspects and natural infection of anophelines (Diptera: Culicidae) captured in the municipalities of the mountainous region of Espírito Santo state was performed in 2004 and 2005. Similarly, between 2014 and 2015, 12 monthly collections were performed at the same area of the study mentioned above. METHODS Center for Disease Control (CDC) light traps with CO2 were set in open areas, at the edge and inside of the forest (canopy and ground), whereas Shannon traps were set on the edge. FINDINGS A total of 1,414 anophelines were collected from 13 species. Anopheles (Kerteszia) cruzii Dyar and Knab remained the most frequently captured species in the CDC traps set in the forest canopy, as well as being the vector with the highest prevalence of Plasmodium vivax/simium infection, according to molecular polymerase chain reaction techniques. CONCLUSIONS P. vivax/simium was found only in abdomens of the mosquitoes of the subgenus Nyssorhynchus, weakening the hypothesis that this subgenus also plays a role in malaria transmission in this specific region.

Determinantes ambientais e não-ambientais da transmissão do plasmódio na paisagem urbana amazônica e suas consequências clínicas: estudo de base populacional em Mâncio Lima, Acre / Environmental and non- environmental determinants of plasmodium transmission in the Amazonian urban ladscape and its clinical consequences: a population- based study in Mâncio Lima, Acre

Este estudo avaliou as mudanças ambientais da paisagem urbana de um município com alta incidência de malária na Amazônia brasileira (Mâncio Lima, Acre) e sua relação com a doença, com o objetivo de prover evidências de que a transmissão do Plasmódio é causada pelo modo como os seres humanos interagem com o meio-ambiente. Foram efetuados três estudos populacionais consecutivos, entre 2012 e 2013, com 1260 indivíduos, com identificação do plasmódio por microscopia e técnicas moleculares. Casos de malária foram analisados mediante um questionário clinico. O estudo entomológico envolveu 8 inquéritos transversais com coleta de formas imaturas em 90 corpos d’água, bem como avaliação espacial desses dados. Os resultados mostraram que a transmissão de malária na área deveu-se em grande parte a criação de tanques de piscicultura, que elevaram em cerca de 10 vezes a produtividade de imaturos de Anopheles darlingi, e à grande mobilidade da população, que se desloca para áreas de maior transmissão (como área ribeirinha e rural) e retorna infectada para a área urbana. Foram identificados casos de portadores assintomáticos do Plasmódio, embora em pequena quantidade. Os fatores associados a ausência de sintomas (infecção assintomática) foram o sexo e o tempo da última malária. Em pacientes sintomáticos, a frequência dos sintomas se relacionou com idade, número de malárias previas e parasitemia. A concentração geográfica dos casos deveu-se em parte a características socioeconômicas agregadas no espaço, em conjunto com fatores ambientais como presença do vetor, visto que o uso infrequente de mosquiteiro associouse com a incidência maior de malária.

This study evaluated the environmental changes of the urban landscape of a municipality with a high incidence of malaria in the Brazilian Amazon (Mâncio Lima, Acre) and its relation with the disease, in order to provide evidence that the transmission of Plasmodium is caused by the way humans interact with the environment. Three consecutive population studies were carried out between 2012 and 2013, with 1260 individuals, with plasmodium identification by microscopy and molecular techniques. Malaria cases were analyzed using a clinical questionnaire. The entomological study involved 8 cross-sectional surveys with collection of immature forms in 90 bodies of water, as well as spatial evaluation of these data. The results showed that the transmission of malaria in the area was largely due to the creation of fish tanks, which increased the immature productivity of Anopheles darlingi by around 10 times, and the great mobility of the population, which moves to areas of greater transmission (as riverside and rural area) and returns infected to the urban area. Cases of asymptomatic Plasmodium carriers have been identified, albeit in small numbers. Factors associated with absence of symptoms (asymptomatic infection) were the sex and time of the last malaria. In symptomatic patients, the frequency of symptoms was related to age, number of previous malaria and parasitemia. The geographic concentration of the cases was due in part to aggregate socioeconomic characteristics in space, together with environmental factors such as vector presence, since the infrequent use of mosquito nets was associated with a higher incidence of malaria.

Prevalence of anemia in non-severe malaria cases in Mâncio Lima, Acre

Malaria, a parasitic disease, is a serious public health problem. In Brazil, the majority of cases are found in the Amazon. The clinical manifestations of malaria depend on several factors and they may be related to the development of anemia. This study evaluated the prevalence of anemia in malaria cases and its associated factors. The study was conducted in Mâncio Lima (Acre, Brazil). Participants were chosen through passive detection of malaria cases in the municipal health services. They were interviewed and blood samples analyzed for Plasmodium detection and for hemoglobin measurement. SPSS 13.0, software was applied for statistical analysis. One hundred and twenty patients with malaria were studied, of which 58.3% male and 41.7% female. There was a 25% prevalence of anemia, mainly among the women, and in those presenting symptoms for more than four days as well as headaches. The prevalence of anemia and its associated factors in these malaria patients may be connected, not only to the infection, but also to previous or overlapping diseases

Anopheles (Kerteszia) cruzii (DIPTERA: CULICIDAE) IN PERIDOMICILIARY AREA DURING ASYMPTOMATIC MALARIA TRANSMISSION IN THE ATLANTIC FOREST: MOLECULAR IDENTIFICATION OF BLOOD-MEAL SOURCES INDICATES HUMANS AS PRIMARY INTERMEDIATE HOSTS / Anopheles (Kerteszia) cruzii (Diptera: Culicidae) em área peridomiciliar durante transmissão de malária assintomática na Mata Atlântica: identificação molecular das fontes de repasto sanguíneo indica humanos como hospedeiros intermediários primários

Anopheles (Kerteszia) cruzii has been implicated as the primary vector of human and simian malarias out of the Brazilian Amazon and specifically in the Atlantic Forest regions. The presence of asymptomatic human cases, parasite-positive wild monkeys and the similarity between the parasites infecting them support the discussion whether these infections can be considered as a zoonosis. Although many aspects of the biology of An. cruzii have already been addressed, studies conducted during outbreaks of malaria transmission, aiming at the analysis of blood feeding and infectivity, are missing in the Atlantic Forest. This study was conducted in the location of Palestina, Juquitiba, where annually the majority of autochthonous human cases are notified in the Atlantic Forest of the state of São Paulo. Peridomiciliary sites were selected for collection of mosquitoes in a perimeter of up to 100 m around the residences of human malaria cases. The mosquitoes were analyzed with the purpose of molecular identification of blood-meal sources and to examine the prevalence of Plasmodium. A total of 13,441 females of An. (Ker.) cruzii were collected. The minimum infection rate was calculated at 0.03% and 0.01%, respectively, for P. vivax and P. malariae and only human blood was detected in the blood-fed mosquitoes analyzed. This data reinforce the hypothesis that asymptomatic human carriers are the main source of anopheline infection in the peridomiciliary area, making the probability of zoonotic transmission less likely to happen.

Anopheles (Kerteszia) cruzii é o vetor primário das malárias humana e simiana fora da Amazônia Brasileira e especificamente nas regiões de Mata Atlântica. A presença de casos humanos assintomáticos, macacos silvestres positivos para Plasmodium e a similaridade entre os parasitas que os infectam suportam a discussão se essas infecções podem ser consideradas como zoonoses. Embora muitos aspectos da biologia de An. cruzii já tenham sido abordados, estudos conduzidos durante surtos de transmissão de malária, visando a análise de repasto sanguíneo e infectividade, são ausentes na Mata Atlântica. Este estudo foi conduzido na localidade de Palestina, Juquitiba, Mata Atlântica do Estado de São Paulo, onde anualmente a maioria dos casos humanos autóctones é notificada. Locais em peridomicílio foram selecionados para coleta de mosquitos em um perímetro de até 100 m em torno das residências de casos humanos de malária e da floresta circundante. Os mosquitos foram analisados com o objetivo de identificação molecular das fontes de repasto sanguíneo e para examinar a prevalência de Plasmodium. Um total de 13.441 fêmeas de An. (Ker.) cruzii foi coletado. A taxa de infecção mínima foi calculada a 0,03% e 0,01%, respectivamente, para P. vivax e P. malariae e somente sangue humano foi detectado nos mosquitos analisados que se alimentaram com sangue. Nossos dados reforçam a hipótese de que os portadores humanos assintomáticos são a principal fonte de infecção para os anofelinos na área do peridomicílio, tornando a transmissão zoonótica improvável.

Intragenomic variation in the second internal transcribed spacer of the ribosomal DNA of species of the genera Culex and Lutzia (Diptera: Culicidae)

Culex is the largest genus of Culicini and includes vectors of several arboviruses and filarial worms. Many species of Culex are morphologically similar, which makes their identification difficult, particularly when using female specimens. To aid evolutionary studies and species distinction, molecular techniques are often used. Sequences of the second internal transcribed spacer (ITS2) of ribosomal DNA (rDNA) from 16 species of the genus Culex and one of Lutzia were used to assess their genomic variability and to verify their applicability in the phylogenetic analysis of the group. The distance matrix (uncorrected p-distance) that was obtained revealed intragenomic and intraspecific variation. Because of the intragenomic variability, we selected ITS2 copies for use in distance analyses based on their secondary structures. Neighbour-joining topology was obtained with an uncorrected p-distance. Despite the heterogeneity observed, individuals of the same species were grouped together and correlated with the current, morphology-based classification, thereby showing that ITS2 is an appropriate marker to be used in the taxonomy of Culex.

Primeiro registro de Anopheles (Kerteszia) homunculus Komp (Diptera, Culicidae) no Estado do Espírito Santo, Brasil / First record of Anopheles (Kerteszia) homunculus Komp (Diptera, Culicidae) in the state of Espírito Santo, Brazil

Em pesquisa de campo realizada no interior do Estado do Espírito Santo, Brasil, em janeiro de 2006, como parte de projeto sobre a transmissão de Plasmodium, foram coletadas larvas de anofelinos em bromélias. Os imaturos foram mantidos no laboratório até a obtenção dos adultos machos e fêmeas associados com as exúvias das larvas e das pupas, para serem identificados. Conseqüentemente, verificou-se que dois espécimes pertenciam a Anopheles (Kerteszia) homunculus Komp, 1937. Este é o primeiro registro dessa espécie de Kerteszia no Espírito Santo. O encontro evidencia a importância de estudos adicionais de modo a estabelecer a distribuição geográfica do An. homunculus, bem como o status taxonômico e a importância epidemiológica da espécie na dinâmica da transmissão da malária em áreas de Mata Atlântica.

In a field collecting trip carried out in the State of Espírito Santo, Brazil, in January 2006, as part of a study on Plasmodium transmission, Anophelinae larvae were collected in bromeliads. The immatures were raised in the laboratory until adult stage, and thus adults male and female and their associated larval and pupal exuviae were mounted and identified. Consequently, it was verified that two specimens belong to Anopheles (Kerteszia) homunculus Komp, 1937. This is the first record of that Kerteszia species in Espírito Santo. The present finding shows the importance of additional studies aiming to establish the geographical distribution of An. homunculus in addition to the taxonomic status and the epidemiological importance of the species in the dynamics of malaria transmission in areas of Atlantic Forest.

First record of Anopheles (Anopheles) costai Fonseca & Ramos, 1939 in Espírito Santo State, Brazil

Field collections of immatures and adults of Culicidae were carried out in the Rio Doce Valley, Espírito Santo State, aiming to increase knowledge on the anopheline species of that region. Considering all Culicidae species collected, among other anopheline it is noteworthy the presence of Anopheles darlingi, An. oswaldoi and An. costai. Regarding to An. darlingi, responsible for malaria outbreak in the low lands in that state, it was expected to confirm its presence in the area. The register of specimens of An. costai in the field collections is relevant, increasing the geographical distribution of the species and representing better knowledge of the Series Arribalzagia of the subgenus Anopheles.

Empreenderam-se coletas de imaturos e adultos de Culicidae no Vale do Rio Doce, Estado do Espírito Santo, Brasil, com o objetivo de ampliar o conhecimento sobre os anofelíneos dessa região. Do material obtido, além de outros anofelíneos e demais mosquitos, destaca-se a presença de Anopheles darlingi, An. oswaldoi e An. costai. Quanto ao An. darlingi, responsável por surtos de malária nas regiões baixas daquele Estado, já se esperava a confirmação de sua presença. Assinala-se como relevante a captura de espécimes de An. costai, ampliando-se a distribuição geográfica da espécie, bem como, trazendo contribuição para o conhecimento da Serie Arribalzagia do subgênero Anopheles.

Natural infection of phlebotomines (Diptera: Psychodidae) in a visceral-leishmaniasis focus in Mato Grosso do Sul, Brazil

The main purpose of this study was to investigate natural infection by Leishmania in phlebotomine females in a visceral-leishmaniasis focus in Antonio João county in Mato Grosso do Sul State, Brazil. Between June and October 2003, the digestive tracts of 81 females captured in Aldeia Campestre, Aldeia Marangatu and Povoado Campestre were dissected. The females were separated by species, location, area and date of capture into 13 groups and kept in ethanol 70 percent. To identify the Leishmania species using the PCR technique, amplifications of the ribosomal-DNA (rDNA) and mini-exon genes were analyzed. Of the 81 specimens, 77 (95 percent) were Lutzomyia longipalpis, making this the most common species; only one specimen of each of the species Brumptomyia avellari, Evandromyia cortelezzii, Evandromyia lenti and Nyssomyia whitmani was found. Trypanosomatids were identified in eight of the nine groups of Lutzomyia longipalpis (10.39 percent) one group from Aldeia Campestre, one from Aldeia Marangatu and six from Povoado Campestre; of the eight groups, one from Aldeia Marangatu and another, with promastigotes forms also confirmed by dissection (1.23 percent) from Povoado Campestre, were identified by PCR as Leishmania chagasi (2.6 percent). The other groups gave negative results. These findings indicate that there is a high risk of leishmaniasis transmission in this area.

Com o objetivo de investigar a infecção natural por Leishmania em fêmeas de flebotomíneos, em um foco de leishmaniose visceral, no município de Antônio João, Estado de Mato Grosso do Sul, no período de junho a outubro de 2003, dissecou-se o trato digestivo de 81 fêmeas de cinco espécies de flebotomíneos capturadas em três localidades: Aldeia Campestre, Aldeia Marangatu e Povoado Campestre. Após dissecção estas foram divididas em 13 grupos monoespecíficos e armazenadas em etanol 70 por cento. Para identificação das espécies de Leishmania pela técnica de PCR, esses grupos foram analisados por meio da amplificação dos genes de DNA ribossômico e mini-exon. Das fêmeas analisadas, Lutzomyia longipalpis foi a espécie mais freqüente com 95 por cento (77/81) dos espécimes e apenas um exemplar das demais espécies, Brumptomyia avellari, Evandromyia cortelezzii, Evandromyia lenti e Nyssomyia whitmani, foi encontrado. Tripanosomatídeos foram identificados em oito dos nove grupos de L. longipalpis (10,39 por cento), sendo um da Aldeia Campestre, seis do Povoado Campestre e um da Aldeia Mangaratu. Desses, dois (2,6 por cento) foram identificados, por PCR, como Leishmania chagasi sendo um proveniente da Aldeia Mangaratu e outro, que em dissecção apresentou formas promastigotas (1,23 por cento), proveniente de Povoado Campestre. Os demais grupos foram negativos. Esses resultados apontam para um alto risco de transmissão de leishmaniose na área.

Prevalence and spatial distribution of intestinal parasitic infections in a rural Amazonian settlement, Acre State, Brazil / Prevalência e distribuição espacial de parasitoses intestinais em assentamento agrícola na Amazônia rural, Acre, Brasil

A population-based survey of the prevalence and spatial distribution of intestinal parasitism was carried out in an agricultural settlement in the Amazon Basin of Brazil (Granada, Acre State). More than half (53.4 percent) of the 429 stool specimens from subjects in all age groups, living in 113 households, had cysts, ova, or larvae of intestinal parasites. The most prevalent parasites were Giardia duodenalis (19.6 percent) and soil-transmitted helminths (12.7 percent); 105 (24.5 percent) subjects were infected with more than one species of parasite. Significant age-related differences in prevalence were only found for G. duodenalis (children < 1 year and adults > 30 years were less affected). Six households (5.3 percent), situated within a radius of 690m, comprised 48.1 percent of all subjects harboring soil-transmitted helminths in our study area. Households within this cluster were poorer and more crowded than those outside the cluster. The observed spatial clustering of infections with soil-transmitted helminths provides valuable information for the spatial targeting of sanitary interventions in this area.

Estudo de base populacional sobre a prevalência e distribuição de parasitoses intestinais foi realizado em assentamento agrícola na Amazônia Brasileira (Granada, Acre). Mais da metade (53,4 por cento) das 429 amostras analisadas de indivíduos de todas as idades, moradores de 113 domicílios, continha cistos, ovos ou larvas de parasitas intestinais. Os parasitas intestinais de maior prevalência foram Giardia duodenalis (19,6 por cento) e os geo-helmintos (12,7 por cento); 105 (24,5 por cento) indivíduos apresentavam co-infecção por mais de uma espécie de parasita. Houve diferença significativa em relação à idade na prevalência somente de G. duodenalis (crianças < 1 ano e adultos > 30 anos foram menos afetados). Seis domicílios (5,3 por cento), localizados num raio de 690m, concentraram 48,1 por cento de todos os indivíduos infectados por geo-helmintos na área de estudo. Domicílios incluídos nesse agregado (cluster) eram mais pobres e com maior número de habitantes do que os domicílios localizados fora do agregado. A distribuição espacial dos agregados de casos de infecção por geo-helmintos fornece informações valiosas para intervenções sanitárias na comunidade da área de estudo.

Padronização de condições para detecção de DNA de Leishmania spp. em flebotomíneos (Diptera, Psychodidae) pela reação em cadeia da polimerase / Standardization of conditions for PCR detection of Leishmania spp. DNA in sand flies (Diptera, Psychodidae)

A correta identificação dos agentes etiológicos em insetos vetores é de crucial importância aos estudos epidemiológicos. A pesquisa de flagelado nesses vetores, pela dissecção de seu trato digestivo, observação microscópica do seu conteúdo ou por isolamento dos parasitas provenientes de insetos em meios de cultura, tem-se mostrado operacionalmente inadequada e com baixa especificidade do diagnóstico, pois fêmeas de flebotomíneos também podem albergar outros flagelados como Trypanosoma e Endotrypanum. Acreditamos que por sua eficiência e especificidade, a amplificação de seqüências-alvo do DNA da Leishmania, por meio da reação em cadeia de polimerase, pode ser aplicada na investigação de sua presença em flebotomíneos, desde que estes estejam devidamente acondicionados e o DNA do parasita extraído a partir de metodologia adequada. Este trabalho descreve metodologias utilizadas na padronização da conservação dos espécimes de flebotomíneos e extração do DNA da Leishmania como uma alternativa mais prática que os métodos tradicionais.

The correct identification of etiological agents in vector insects is crucial for epidemiological studies. Identification of flagellates in such vectors, usually by dissection of the digestive tract and microscopic observation of the contents as well as attempts at parasite isolation from insects in culture media, have proven operationally inadequate and with poor diagnostic specificity, since female sand flies are also hosts for other flagellates like Trypanosoma and Endotrypanum. Due to the efficiency and specificity of DNA target sequence amplification by polymerase chain reaction (PCR), the latter could be used to investigate the presence of Leishmania in sand flies, although the insects need to be properly stored and the Leishmania DNA extracted using appropriate methodology. This paper describes methodologies to standardize sand fly storage and Leishmania DNA extraction in such specimens as a more practical method in field studies.

The Acre Project: the epidemiology of malaria and arthropod-borne virus infections in a rural Amazonian population

The authors describe the baseline malaria prevalence and arbovirus seroprevalence among 467 subjects in an ongoing cohort study in rural Amazonia. Most subjects (72.2 percent) reported one or more previous episodes of malaria, and 15.6 percent had been hospitalized for malaria, but only 3.6 percent of individuals five years or older had malaria parasites detected by microscopy (10 with Plasmodium vivax and 4 with P. falciparum). Antibodies to Alphavirus, Orthobunyavirus, and/or Flavivirus were detected by hemagglutination inhibition (HI) in 42.6 percent of subjects aged five years or older, with a higher seropositivity rate among males (49.2 percent) than females (36.2 percent). Since 98.9 percent of subjects had been immunized for yellow fever, the presence of cross-reactive antibodies to dengue and other Flaviviruses cannot be ruled out, but at least 12 subjects (3.3 percent) with IgM antibodies to dengue virus detected by ELISA had a putative recent exposure to this virus.